Cryogénie cannabique !!!

[Moricio 91]

salut !

 

juste pour faire mon chieur :

C'est impossible de congeler (ou même cryogénisé)du vivant et de le ranimer par la suite (sinon ça se saurait !), faut arrêter de fumer à ce niveau là !

 

c'est faux , on congèle bien des cellules quand on souhaite conserver un culture cellulaire de tissus .

 

A+

[xylae 0]

Un peu de science dans ce monde de brute.

Alors pour répondre à Carbont44 qui dis : "sans O2 pas de vie" oui et non.

 

(Oui certe pour les plantes terrestre puisqu'elle respire mais que dis tu des organismes marins vivant à côté des dorsales leur substrat energétique n'est pas l'O2 mais le souffre.

Petite leçon de biochimie l'O2 est nécessaire pour produire l'energie dans les cellules en grande quantité c'est l'accepteur final des electrons).

 

Pour la congélation, certaines espèces de plantes sont capables resister à des températures très négatives si le froid est progressif parce qu'elles vont synthétiser des protéines qui vont empecher la formation des cristaux de glace et protéger les métabolites de la cellules (jusqu'a une certaine limite), plus le % d'eau est faible plus l'organisme à une chance de resister au gel (c'est le cas des graines).

Mais une pauvre bouture, qui ne "sait pas" racourci scientifique comment faire ces protéines "anti-gel" et qui est composé à 90% d'eau je crois pas que ça ai des chances de marcher.

Notons tout de même que la congélation du vivant ça existe figurez vous.

Comment sont conservés les spermatozoides, les lignées cellulaires etc. Dans de l'azote liquide à -196 °C . Mais les cellules sont congelées lentement avec des produits protecteurs.

A ce jour je ne crois pas qu'aucun organisme entier pluricellulaire n'ai resiter à la congélation.

Quant à la cryogénisation, même combat. (même si ça fait beaucoup plus science fiction)

 

Bref tout ça pour dire (désolée si je vous ai soulé) qu'il faut arrêter de vouloir faire du mal aux boutures à tout pris.

Pauvres plantes :/

 

EDIT: je me suis fait piqué mon exemple pendant que j'écrivais

[Sir_Galahad 28]

Ouaip,

 

A ce jour je ne crois pas qu'aucun organisme entier pluricellulaire n'ai resiter à la congélation.

 

Il me semble que des cafards et même des grenouilles passent l'hiver congelés comme des glaçons...

 

Ensuite, j'imagine que leurs cellules ne gèlent pas vraiment, ils possèdent des protéïnes antigel et tout un tas d'autres trucs...

 

Xylae, en sais tu d'avantage sur la congélation des embryons et autres cellules reproductrices ? Je ne comprends toujours pas comment les cellules peuvent résister à la formation de cristaux de glace et donc à leur éclatement...

 

++

[Moricio 91]

re !

 

Xylae, en sais tu plus su la congélation des embryons et autres cellules reproductrices ? Je ne comprends toujours pas comment les cellules peuvent résister à la formation de cristaux de glace et donc à leur éclatement...

 

je te resort mes feuilles de cours lundi prochain . mais de souvenir sa se fait en jouant sur la durée de refroidissement et de réchauffement ainsi qu'en ajoutant diverse produit ralentissant la formation de cristaux .

 

A+

[xylae 0]

Effectivement Sir galahad tu as tout a fait raison (mille excuses) certains être vivant sont capables de survivre à des températures négatives, Ici une petite description

mais c'est une capacité d'adapation c'est acquis au cours de l'évolution tout les organismes si ils sont mis au contact pendant un certains temps (variable) au contact de T° négative n'ont pas la capacité de survivre.

Pour le protocole pour congeler les cellules, pas de soucis,lundi je regarde au labo le protocole et ce qu'on utilise (mais à priori c'est du DMSO) là j'avoue je vais bientot me casser et j'ai pas envie d'aller chercher un protocole.

Des cellules j'en ai décongeler et je confirme c'est bien vivant

[Sir_Galahad 28]

lundi je regarde au labo le protocole et ce qu'on utilise (mais à priori c'est du DMSO) là j'avoue je vais bientot me casser et j'ai pas envie d'aller chercher un protocole.

 

Ah bravo, ça fait du cannaweed au boulot, c'est du propre...

 

Mais sinon ce n'est pas vraiment le protocole qui m'interesse mais plutôt l'explication elle même...

 

Pourquoi la cellule n'éclate t elle pas ? Et même si elle n'eclatait pas, des dommages irréversibles devraient etre causés...

 

++

 

PS: ah oui et au fait, j'ai toujours raison mouhahaha :-D

[mh69130 1]

Lu all

 

grenouilles passent l'hiver congelés comme des glaçons

 

+1 Sir pour la grenouille, la grenouille des bois pour etre précis.

 

Elle passe tout l'hivers gelée mais pour se faire 65% de son eau se retire de ses organes (foie, coeurs...) et s'accumule dans son abdomen.

En meme temps son taux de sucre augmente de manière spectaculaire pour abaisser la température de solidification de l'eau.

@++ MH.

[Sir_Galahad 28]

Elle passe tout l'hivers gelée mais pour se faire 65% de son eau se retire de ses organes (foie' date=' coeurs...) et s'accumule dans son abdomen.

En meme temps son taux de sucre augmente de manière spectaculaire pour abaisser la température de solidification de l'eau.[/quote']

 

Oui, donc c'est bien ce que je disais, elle n'est pas vraiment congelée...

 

Mais pour les embryons alors ?

 

++

[papyraleur 5]

Salut a tous

 

Je viens mettre mon grain de sel. Oui faut pas etre méchant mais bon faut pas etre bourrin non plus quand on te répond sa marche pas.(cela me rappel celui qui voulait cloner des feuilles)

 

Pour faire super simple le probléme c'est l'eau qui en se solifiant augmente en volume donc ce qui peut ce faire au niveau d'une céllule (encore faut il le % d'eau) ne peut se faire (sauf dame nature) au niveau d'un organisme plus complexe.

 

J'esperes que j'ai pas soulé non plus. Mais le mieux c'est qu'il essaye il fait un jdc des photos et tout et on verra.

 

Moi perso je dis la plante elle creve

 

Bon bonne soirée et bon week end a tous

[Apprentijedi 1]

AH MERCI POUR CES PRECISIONS !

 

Donc en résumant et sans être agressif une bouture (on parle pas de tête seche mais bien des boutures)ne peut pas être congelée et être réanimé, replanter, devenir une plante mère...

Tout ça pour en revenir aux réponses du départ ! (ça frole un poil le ridicule mais bon...)

 

Maintenant on enfonce le clou !

 

Notons tout de même que la congélation du vivant ça existe figurez vous.

Comment sont conservés les spermatozoides, les lignées cellulaires etc. Dans de l'azote liquide à -196 °C . Mais les cellules sont congelées lentement avec des produits protecteurs.

 

Ca, on en ok mais pour un particulier impossible, surtout en ce qui concerne la problématique du départ !

Donc pour te montrer que je ne m'énerve pas pour rien, voilà un petit cour sur l'art et la manière de congeler et conserver des cellules et on parle pas de tissus vivants !(c'est pas du tout la même chose...)

 

CONGÉLATION DES CELLULES

Primo

Pour bien réussir la congélation de ses cellules, il est TRÈS important que les cellules soient en phase exponentielle, pas trop confluentes. Elles doivent être en bonne santé, le pH du milieu bien rouge, pH 7.2-7.4, pas trop acide.

Trypsination

Procédez comme pour faire un passage.

Enlevez le milieu et rincez avec du PBS

Enlevez le PBS et ajoutez un peu de trypsin (1.2 à 2 ml)

Laissez le temps aux cellules de se détacher facilement.

Séparez les cellules en les triturant (mouvement de va et vient dans le fond du pétris) plus ou moins fort selon le type cellulaire.

Arrêtez la trypsine en ajoutant une quantité de milieu complet (au moins la même quantité ou plus)et complétez à un volume fixe.

Exemple : si dans un pétris de 100mm vous avez trypsiné avec 1.5ml de trypsine et ajouté 8.5ml de milieu complet pour un total de 10ml

Comptage des cellules

Cette étape permet d’établir la quantité de cryovials que nous allons avoir besoin à partir du ou des pétris que nous avons. La concentration idéale est de 4 à 6 millions de cellules par ml /par cryovial. Dans le cas ou vous auriez trop de cellules via la quantité de milieu de congélation, les cellules pourraient crever à cause d’un manque de nutriments qui les préservent. Dans le cas contraire, il n’y a pas assez de cellules (plus diluées), il n’y a pas vraiment de problème. Le seul inconvénient va se présenter lors de la décongélation. Les cellules, si trop diluées, ont de misère à survivre. Pour contrer ce problème, déposez-les dans un plus petit contenant, dans un plus petit volume de façon à les concentrer d’avantage. Nous savons, par expérience, que la quantité suggérée plus haut (4-6Millions de cellules) repartira facilement dans un pétris de 100mm ou un flacon de 75 cm2.

Revenons à nos moutons. Nos cellules sont dans un tube de 15ml dans un volume de 10ml. On prélève un aliquote qu’on dépose sur un hématocymètre. Attention de bien mélanger le tout avant de prendre votre aliquot pour qu’il s’agisse bien d’un mélange homogène. Une fois que vous aurez pris cette aliquote à l’aide de pipette pasteur ou de

tip, NE PAS RETOURNER LE RESTANT DANS LE TUBE, VOTRE HÉMATOCYMÈTRE N’EST PAS STÉRILE LUI. Vous êtes prêt à compter. La quantité que vous déposez doit entrer par capillarité et ne doit pas déborder. Faites le focus au petit objectif pour centrer le carré le plus subdivisé, puis tournez vers un plus gros pour avoir ce même carré dans tout votre champs de vision, soit 25 carrés (5X5) subdivisés en 16(4X4). Pour une mesure plus précise, comptez les deux parties de l’hématocymètre et faites la moyenne. S’il y a trop d’écart entre les deux, recommencez. Le nombre que vous obtiendrez X 10 000 sera la quantité de cellules par ml. Multipliez ensuite par la quantité de volume pour avoir la quantité totale de cellules dans votre tube.

Exemple : 200 cellules X 10 000 = 2 X 106 X 10m l= 20 X 106 soit 4-5 vials

Vous devez maintenant centrifuger le tube pour concentrer les cellules et les resuspendre dans 4 ou 5 ml de milieu de congélation. Le tout doit congeler lentement soit 1°C/min. Mettre les tubes dans un support de styrofoam et ensuite déposez à –70°C, puis attendre un minimum de 24 heures pour le transférer dans l’azote liquide.

Bien identifier les tubes : type cellulaire, passage, mutant si, date, etc.

Le passage indiqué est soit celui d’avant, ou le passage suivant, peut importe, en autant que vous faites de la même façon à chaque fois, nous retenons que de congeler les cellules c’est la même chose que d’effectuer un passage. Que vous l’ajoutiez avant ou après importe peu, en autant que vous l’ajoutez.

Milieu de congélation

Normalement, vous suivez les recommandations du fabriquant (ATCC) ou sinon, on se prépare un milieu de base. Ce milieu contient entre 5 à 10% DMSO, le double de sérum utile normalement et votre milieu dans lequel les cellules poussent mais sans généticin ou autre antibiotique si possible (pen/strep) ne dérange pas beaucoup.

Voyons pour des 293 (HEK) 10% DMSO + 20% FBS + 70% DMEM. Ce milieu doit être assez frais préparé. Semble-t-il que le DMSO pourrait être contaminé si vous êtes plusieurs à utiliser la même bouteille, il serait bon de filtré la solution sur 22um.

Décongélation

La décongélation se fait rapidement, au bain-marie à 37°C en agitant. Nettoyez le cryovial avec EtOH 70% avant de l’ouvrir. Notez que le DMSO prend environ 20 minutes pour sortir de la cellule. C’est le but de cette étape, se débarrasser du DMSO. Si ce dernier demeure trop longtemps en contact avec les cellules, le DMSO pourrait affecter vos membranes.

Effectuons maintenant la chose. On vide le contenu du cryovial dans une boîte de Pétri et lentement, pour le premier millilitre (1 ml/min), on y dépose le milieu complet, puis, plus rapidement pour le reste. Vous pouvez attendre simplement que les cellules s’attachent

2

(2-24 hres) et changer pour du milieu frais. Certaines cellules sont très sensibles au DMSO, comme les COS-1, il faudra changer le milieu après 2-3 heures maximum.

Sauvetage : Si vous avez eu des problèmes à la décongélation avec certains vials, que les cellules meurent et que vous soupçonné une contamination quelconque, il serait préférable de les centrifuger, de faire des lavages et de les resuspendre dans un milieu complet contenant un antibiotique sûr du genre ciprofloxacin ou plasmocin. Le principe étant que par les lavages, vous vous débarrassez des indésirables dès le départ et avec de la chance, sauvez le dernier vial qui vous reste. Un supplément de sérum (15%) apporte des facteurs d’attachement au milieu.

Dans le cas de cellules en suspension, on peut aussi re-suspendre les cellules (tube de 15 ml), attendre 30 minutes et centrifuger pour se débarrasser du DMSO restant.

C’est alors qu’il faut être patient et attendre que les cellules deviennent assez confluentes pour les passer. Idéalement, 1-3 jours seraient préférables pour bien permettre aux cellules de bien s’attacher, reprendre leurs fonctions normales avant de leur faire subir un autre stress. De toute façon, les cellules vont pousser mieux et plus vite lorsqu’elles sont concentrées que si on décidait de les passer le lendemain de la décongélation. Donnez-leur une chance!

À noter, après la décongélation, faites un ou deux passages avant de reprendre vos manipulations ou de recongeler vos cellules. Apprenez le sens du mot PLANIFICATION. Des cellules congelées dans l’azote devraient, théoriquement, se conserver 5 ans et à –70°C, un an pas plus. Il est nécessaire de renouveler le stock à l’occasion.

 

BON COURAGE MEC !

 

c'est faux , on congèle bien des cellules quand on souhaite conserver un culture cellulaire de tissus

C'est vrai mais je suis très faignant donc je voulais faire simple !

Mais tu constatera que s'il faut rentrer dans le détail je suis là !

De plus, j'ai perdu quand même 10 min de mon "précieux" temps pour répondre à un gars qui n'appréciera même pas mon petit travail...

 

Quant a ça:

Enfin je n'ai agressé personne autant que je sache dans ce sujet de forum (dont je suis l'auteur).

Aussi si mes interventions ne te conviennent pas, il m'apparaît préférable de passer ton chemin plutôt que d'être désagréable...

JE DIRAIS PLUTOT FRANC MAIS BON "TOUT EST UNE QUESTION DE POINT VU" !

 

Pour ceux qui critique ma réponse, je leur répondrai qu'au lieu de poster et de critiquer les réponses des autres, ils n'ont qu'à chercher des infos ou faire partager leurs sciences comme là fait "XYLAE" au lieu de tailler l'auteur !

D'une part, ça fait pas avancer le débat !(qui aurait du être clos depuis bien longtemps...)

D'autre part, ça n'a aucun intérêt si ce n'est effectivement chercher querelle !

 

Si c'est ça ! Ca finira forcement en "bagarre" verbale (voir même diarée) ou:

 

Sur ce je m'envais !

 

A+ (pour d'autres questions inutiles...)

[xylae 0]

Merci aprenti Jedi pour ce protocole ça m'évite de devoir le chercher lundi. Toute petite précision (ouais c'est juste pour être vraiment très précis hein)la tryspsine c'est que dans le cas des cellules adhérentes sinon on en as pas besoin.

 

Quant à tes question Galahad je pense que je le protocole de aprenti jedi devrait t'aider, et je rajouterais ceci spécialement pour les embryons:

 

-dans une solution de propanediol (PROH) 1.5M pendant 20 mn à température ambiante

 

- puis dans une solution de PROH 1.5M + 0.1M sucrose pendant 10 mn avant la mise en paillette

 

La descente en température est de :

 

- 2°C/mn de la température du laboratoire Þ - 6.5°C

 

- attendre 5mn l’équilibration de la température

 

- induction de la cristallisation

 

- 0.3°C/mn Þ - 38°C

 

- plonger les paillettes dans l’azote liquide.

 

Les embryons qui sont congeler sont au stade 4 cellules et je t'ai trouvé l'explication de pourquoi alors qu'ils sont composés à 90% d'eau ils n'éclatent pas (tout est une question de potentiel osmotique).

La possibilité de congeler les embryons a été proposée dès 1983. Il a été démontré que les embryons stockés dans l’azote liquide (-196°C) conservaient un potentiel évolutif.

 

Si le nombre d’embryons obtenus est supérieur au nombre d’embryons transférés, les embryons surnuméraires peuvent être congelés à condition qu’ils soient de très bonne qualité (grades 3 et 4). La congélation s’effectue au stade 4 cellules dans de l’azote liquide à -196° C..

 

L’embryon, à ce stade, est constitué de plus de 90% d’eau. Il est donc nécessaire d’éviter la formation de cristaux de glace qui par augmentation de volume déchireraient les membranes cellulaires lors de la congélation.

On élimine donc l’eau en la remplaçant par un cryoprotecteur, véritable "antigel" cellulaire.

L’embryon est plongé dans des bains successifs contenant le cryoprotecteur et du sucrose à des concentrations différentes.

Le sucrose rend le milieu hypertonique par rapport à l’embryon, ce qui entraîne la sortie de l’eau et la rentrée du cryoprotecteur. L’embryon est placé dans une paillette en plastique de 13 cm de longueur et de 2 mm de diamètre contenant un volume de 0,3 ml, une partie de la paillette contient toutes les indications nécessaires à une bonne identification.

(source site CHU de TOULOUSE)

Voilà j'espère que ça a répondu à ta curiosité

Quant à l'auteur du post, je sais pas si il a tout lu, mais j'espère parce que je suis sure qu'il aura apris des trucs.

[Invité locki]

Il me semble que des cafards et même des grenouilles passent l'hiver congelés comme des glaçons...

 

salut, je croi qu'il y a aussi la tortue qui peux etre congeler et ramener a la vi,

j'avais vus sa a la tv

[alayx 1]

c'est faux , on congèle bien des cellules quand on souhaite conserver un culture cellulaire de tissus

 

 

C'est vrai mais je suis très faignant donc je voulais faire simple !

Mais tu constatera que s'il faut rentrer dans le détail je suis là !

De plus, j'ai perdu quand même 10 min de mon "précieux" temps pour répondre à un gars qui n'appréciera même pas mon petit travail...

 

Mééé non, je pense que ya deja un tas de gens interessé par ce sujet, sinon ca ferait pas débat

Par contre t'es un peu dur, si il a poser la question, c'est ptet qu'il est interessé lui aussi (on sait jamais ^^)

 

PS: Xylae, t'es de toulouse ou c'est juste une info que t'as eu sur le net par le CHU de toulouse? (question peut etre con mais bon...)

[xylae 0]

Nan je suis pas de TOulouse c'est une Info du net, mais je préfère toujours citer la source c'est bien mieux.

[windowlicker 1]

Je confirme : si je questionne c'est que ça m'interresse !!! (sinon je ne vois pas trop l'intérêt)

Je tiens également à remercier tous ceux qui ont apporté des éléments de réponse à mes interrogations (et je dis bien TOUS !!!)